qpcr引物设计在线网站-rtqpcr引物设计
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简述信息一览：
探针设计在线-如何实现原位杂交之探针设计
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列（即探针）、有与探针结合的标记物（曾呈奎等2000） 。RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
引物设计和探针设计（即荧光探针）有3点不同，相关介绍具体如下：两者的用途不同：引物设计的用途：用于PCR扩增技术。探针设计的用途：用于标记待定的核苷酸片断，用与特异性地、定量地检测核酸的量。
常用的标记方法包括荧光标记、辐射标记和酶标记等。合成探针：将设计好的探针序列进行合成，并进行标记。验证探针特异性：在进行实验之前，需要验证探针的特异性。优化实验条件：进行FISH实验时，需要优化实验条件，包括杂交温度、时间、缓冲液组成等。
如何进行引物设计?
进行引物设计可以引物长度、扩增跨度、引物成分等方面进行。提高扩增效率和特异性，尽可能抑制非特异性扩增。长度：15~30bp均可，常用20±3nt左右，但不应大于38；两个引物长度差异3nt。
引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。碱基要随机分布。引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。遵循原则如下： 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。
荧光定量pcr与FPKM值有什么差别?
区别：二者系统组成不同 荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号***集系统和计算机分析处理系统。二者原理不同 荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。
|||原理不同：荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光；普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量，一般是紫外光。反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。
因此可看到，TPM与RPKM和FPKM相比，唯一的区别是先对基因长度进行归一化，然后对序列深度进行归一化。但是这种差异的影响非常明显。使用TPM时，每个样本中所有TPM的总和是相同的，这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的reads比例。
PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。
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