引物在线设计网站-引物在线设计网站***
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简述信息一览：
如何设计甲基化引物
1、而研究CpG 岛甲基化的前提条件是确认最合适的CpG 岛区域。根据 Gardiner-Garden 等[4]的定义，CpG 岛是一段长度不小于200bp、GC 含量不小于50%、CpG 含量与期望含量之比不小于0.6 的区域。
2、MS-MLPA：通过甲基化特异性PCR，检测40个CpG位点的甲基化状态，区分甲基化和非甲基化。传统PCR与AFLP：通过G/A碱基替换或限制性片段扩增，用于基因组分析的多样手段。提高特异性的技巧 共识引物：通过替换错配核苷酸，如肌苷，增强特异性，减少杂交误差。
3、是根据亚硫酸盐处理后的序列设计引物，就是C都变成了T，但是CG是不变的。设计引物的时候，引物序列尽量不要有cg，有专门的引物设计的网站：百度一下就可以了，这个不让发网站信息的。
primer3.0在线设计引物-如何在Windows7系统中使用PrimerExpress3.0_百...
1、PrimerExpress0是ABI公司开发的一款用于荧光定量PCR引物探针的设计，也是此类软件中最广泛使用的软件之一。但是，PrimerExpress0在XP系统中使用正常，而在Windows7中则会出现无法使用的问题。下面的方法可以解决这一问题。
2、然后你选一段小的位置来做为探针，两端分别加上发光基团与淬灭基团，正常情况下他们不发出信号，在PCR扩增的时候他就会自己结合到目的基因上，然后通过Taq酶的外切酶活性将其切端而发出信号。TaqMan引物没什么特别，特别之处就是有第三方带有发光基团与淬灭基团的序列段。
3、方法/步骤 在win7电脑上安装完Primer Express 0后，打开软件，点新建，发现没有出现序列输入窗口，软件无***常使用。关闭软件，在桌面图标上右键点“属性”，选择“兼容性”栏，在兼容模式中勾选“以兼容模式运行这个程序”，在下面的模式中选择“Windows2000”，确定。
4、使用方法如下：在win7电脑上安装完Primer Express 0后，打开软件，点新建，发现没有出现序列输入窗口，软件无***常使用。关闭软件，在桌面图标上右键点“属性”，选择“兼容性”栏，在兼容模式中勾选“以兼容模式运行这个程序”，在下面的模式中选择“Windows2000”，确定。
如何设计引物
网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。使用BLAST-Primer，您可以输入一个序列或一组序列，并为这些序列设计引物或探针，以便用于PCR扩增或杂交检测等分子生物学实验。需要注意的是，NCBI还有一个网站叫：BLAST。注意二者不要弄混。
引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。碱基要随机分布。引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。
引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
设计引物的方法如下：引物长度一般在15-30bp。引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。引物GC含量一般为40%-60%。引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。
如何选择最佳的cpg岛进行引物设计
根据 Gardiner-Garden 等[4]的定义，CpG 岛是一段长度不小于200bp、GC 含量不小于50%、CpG 含量与期望含量之比不小于0.6 的区域。
找甲基化位点也就CpG岛一般是有以下几个方法： MSP，亚硫酸氢盐转化后，将你想测的基因区域（如启动子区）转入细菌质粒中，进行测序（金标准）。挑克隆7/10是甲基化的克隆认为这个位点70%甲基化。大概可以测400+片段，但是问题是没有办法太精确，因为测得越多越精确，测太多太贵。
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。
通过设计不同的引物进行PCR扩增，根据扩增产物中CpG岛甲基化与否，可以判断基因的甲基化状态。M引物和U引物的选择依据目标基因在甲基化前后序列的变化，有时可能需要两轮扩增以获得更准确的结果。扩增后的产物会通过DNA琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后通过扫描凝胶来解读分析数据。
因此从理论上讲，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。根据目的基因修饰前后的改变，就可以相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。
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